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作者:刘阳(西安交通大医院)黎一鸣(西安医院)杨鹏(西安医院)陆宏伟(西安医院)雷晓鸣(西安医院)卢乐(西安医院) malmodelbuildingmethodwhichhascharactersofoperationsimply,lessbloodlose,highsuccessfulrate,controllingportalveinandhepaticarteryaccurateandlongtimelive. livertransplantation;animalmodel;miniaturepig 动物模型是肝移植临床、基础研究的重要手段，而肝移植的大动物模型则较小动物模型在缺血再灌注损伤、手术方法等方面的研究具有无法比拟的优势。但是传统大动物经典肝移植模型建立手术相对难度较大，不易掌握，且术后存在吻合口并发症以及排斥反应的风险，直接影响模型的成功率及术后长期观察。针对上述问题，我们应用小型猪设计了简易自体肝移植模型，降低的手术难度，提高了手术成功率，并进行了术后长期观察，收到了良好的效果。现报道如下： 材料与方法 实验动物：选取雄性健康巴马小型猪20只，体重20~25kg，年龄9~12月。实验动物于西安交通大学实验动物中心清洁动物房普通喂养。 麻醉方式：所有实验动物均术前12小时禁食，4小时禁水。应用2.5％硫喷妥钠1mg/Kg腹腔内注射诱导，阿托品0.05mg/Kg肌肉注射以减少呼吸道分泌物。行气管插管后，呼吸机辅助呼吸。耳缘静脉建立静脉通路，0.1％氯胺酮静滴维持。术中给予生理盐水ml+青霉素万单位静脉滴注，根据术情况必要时输注羟乙基淀粉。术后静脉输注晶体至动物恢复自主活动。 手术方法：1.取右上腹肋缘下切口入腹，解剖第一肝门，游离胆总管位置，门静脉，以及肝动脉，在门静脉前内侧寻找胃十二指肠动。2.离肝下下腔静脉约2cm。并游离肝上下腔静脉，离断肝周各韧带，使除出、入肝管道外，肝脏完全游离。3.应用22号套管针穿刺胃十二指肠动脉并固定作为动脉灌注通路，远心端予以结扎；18号套管针穿刺门静脉并固定作为门静脉灌注通路；钳夹阻断肝下下腔静脉、门静脉、肝动脉。4.分别经动、静脉灌注生理盐水ml驱肝脏血液回流后，钳夹阻断肝上下腔静脉，并应用4℃含肝素5mg/L的乳酸林格溶液进行灌注，横向剪开肝下下腔静脉前壁约1cm做流出道；5.肝脏呈土黄色后停止灌注，拔除门静脉穿刺套管针，并6-0polyin线八字缝合关闭，5-0滑线连续缝合肝下下腔静脉并预留小口，开放门静脉阻断钳，驱肝内灌注液自肝下下腔静脉流出至流出液颜色鲜红后，继续完全缝合肝下下腔静脉，解除肝上、肝下下腔静脉钳夹，开放肝动脉，拔除动脉穿刺套管针后结扎胃十二指肠动脉；6.检查腹腔无出血后，逐层关腹。 术后处理：术后注意动物保暖，待动物呼吸恢复后，吸痰，拔出气管插管；3个月后，全麻下开腹，松解粘连后，活体观察肝脏及各出入肝血管情况，完整切除动物肝脏并观察。 统计学分析：结果以均数±标准差形式表示，应用SPSS18.0软件进行统计。均数之间的比较应用t检验的方法进行，p＜0.05认为具有统计学意义。 结果 平均手术时间：±37分钟，术中无肝期：8±3分钟，热缺血时间：0分钟，术中平均出血：±70ml。全部动物于术后6小时内自主排尿，24小时内清醒并能站立。并于术后48小时开始进食流质饮食，之后逐渐过渡到正常饮食。术后1周，动物食纳、活动同正常动物相比无区别。术后观察3个月，动物％健康存活，期间并无并发症发生。3个月时，剖腹探查，见全部动物肝脏色泽红润，质软，各出入肝血管血流通畅。完全切除肝脏及周围管道后，纵行切开血管后，见血管无一狭窄。 讨论 自从Stazle在年首次行临床肝移植以来，多年来人们对肝脏移植的研究从未停止，而肝移植相关临床、基础的进展均离不开动物模型的建立。虽然大鼠肝移植模型具有很好地模拟性，但是与肝动脉缺血相关等多方面研究仍需应用大动物进行模拟。这其中，由于猪具与人相比其解剖相似，且饲养方便、容易获得，被广泛应用到肝移植的大动物模型建立[1]。但普通猪由于体型及基因差异较大，常致供肝体积、血管管径不合适以及可能发生急性排除反应，并不适合作为实验动物选择。本实验所选用的巴马小型猪，其体型相近，基因纯合度达为67.3％[2]，是肝移植动物模型的理想选择。不过，虽然小型猪理论上不会发生急性排斥反应，但仍可能发生慢性排除反应，影响实验动物的肝功能及术后长期生存。而自体肝移植则可有效避免排除反应的发生，对于需长期观察的实验，尤为适合。 各吻合口相关并发症的发生则是限制传统肝移植模型动物术后长期生存的另一影响因素[3]。由于血管、胆道吻合技术要求高，且猪的血管、胆道直径较人更细，因此也更易出现吻合口相关的并发症，这种情况在初学者尤为明显[4]。一旦出现相关并发症，则会直接影响动物模型的模拟效果。本模型采用了对于各肝外血管采用钳夹的方法进行阻断，从而无需行血管吻合，仅需对门静脉以及肝下下腔静脉的前壁进行缝合，而这两个血管管径较粗、容易显露。一方面较易完成操作，从而很大程度上降低了肝移植手术的操作技术要求，并减少了出血量；另一方面由于其较粗的管径，又可以有效减少了术后血管狭窄的可能，保证了实验动物术后长期健康的存活。而本组实验动物在术后三个月的随访观察过程中，无一出现血管并发症。另外，有效排除混杂因素也是一个良好动物模型的要求，而钳夹阻断的方式，同样可以在肝移植术后观察过程中排除血管吻合这一混杂因素，这也是本模型的特点之一。 由于客观原因，猪肝移植往往不能得到足够的血制品输注，因此，出血的控制对于手术的成功至关重要。尤其猪的肝上下腔静脉段较短，壁薄，显露困难，吻合空间狭小，是传统肝移植模型的难点，处理不当可能导致致命性出血[5]。本模型的钳夹阻断模拟血管切断、吻合，手术操作更加简单，并可以更加方便的处理第二肝门。在本组实验中，猪的术中平均出血量仅为ml，而这其中失血尚包括来自肝脏灌注所导致的肝内血液丢失。这样的出血量，较文献报道的传统手术的失血量（ml）明显减少（P＜0.05）[5]。而这种较小的创伤优势同样体现在术后。由于猪在清醒状态固定困难，因此术后很难对其进行静脉输液，且术后早期动物食纳差，引起液体量不足。这也是导致传统肝移植动物模型在术后近期死亡的原因之一。而本组动物术后虽无一输液时间超过24小时，而在术后早期仅能进食少量流食的情况下，均健康存活，并逐渐在一周内恢复正常，这与手术中较少的出血量不无关系。 虽然该模型对传统的肝移植手术进行了简化，但是肝脏在原位进行冷灌注，经历了冷、热缺血再灌注损伤，实验动物也经历了无肝前期、无肝期和无肝后期等肝移植手术过程中的各种生理变化，从而很好地模拟了肝移植的手术过程中动物的生理变化。由于该动物模型为肝脏在体原位灌注，且主要血管钳夹阻断，因此本模型肝脏热缺血时间为0，而在对肝脏灌注结束之后就可以结束无肝期。本组实验中，在肝脏灌注结束后，我们就立即开放血管，因此无肝期时间主要为肝脏灌注时间。这个时间也较传统经典肝移植动物模型的无肝期（27分钟）明显减少（P＜0.05）[5]。该模型最短无肝期时间短，且由于其钳夹阻断血管，因此其无肝期则可以根据实验者的意愿进行控制，一方面可以用于研究与无肝期相关的研究，另一方面可以在肝移植动物模型中，使各实验动物的无肝期保持一致，排除了无肝期时间长短不一的影响，这也是本动物模型的另外一个特点。而这种入肝血流均为钳夹阻断，可以很精确的控制入肝血流的开放顺序及开放时间，因此，该实验模型对于肝动脉缺血时间对移植肝影响的相关研究尤为适合。 在模型的设计初期，课题组曾尝试解剖胃十二指肠静脉并穿刺插管进行灌注，但在实践过程中发现，巴马小型猪的胃十二指肠静脉壁薄，管径较细，穿刺该血管常常穿透管壁，而应用插管的方法又管径小，又常撕裂管壁，虽可向该血管内插管，但操作困难，成功率低，常致出血量增加。而门静脉主干管径粗，易于穿刺。灌注后虽需缝合，但刺口小，易缝合且因其管径大，同样不易导致血管并发症的发生。因此，我们在模型的设计中，最终选择经门静脉穿刺灌注的方法。 本模型对于手术方式大为简化，其中操作最为困难点则属穿刺插管环节。模型设计的预实验阶段，我们也曾试用传统的血管内插管方法进行灌注更容易操作。但传统的插管灌注方法的一般采用血管外绑扎的方法固定插管，但这种方法实际中在似胃十二指肠动脉这种较细血管难以固定，结扎过紧则可致灌注困难，结扎松则易脱落，从而影响肝脏灌注。而本模型最终所选用的套管针对血管进行穿刺。一方面穿刺的方法同样容易完成血管内插管，另一方面，套管针尾部本身带有针孔，穿刺成功后，则可通过针孔固定于门静脉鞘及肝十二指肠韧带，而无需行血管外捆扎，且固定效果可靠。 虽然本模型具有上述优势，但是本模型仍然存在一些不足。本模型存在肝脏冷缺血时间同无肝期的矛盾。由于本模型模拟原位经典肝移植手术，且肝脏为在体原位灌注，因此，动物肝脏的无肝期即为肝脏的冷缺血时间。在没有转流的情况下，而无肝期时间又不能无限延长的情况下，肝脏冷缺血时间就显得极为有限。一般认为非转流条件下，猪的无肝期不宜超过30分钟[6,7]，而本组实验肝脏的最大冷缺血时间平均为8分钟。在实际操作中，大多数传统肝移植手术肝脏的冷缺血时间均较此长。因此本模型对于冷保存时间有严格要求的实验研究并不适用。此外，由于该模型为自体移植，且没有进行血管、胆管吻合，因此并不适于血管、胆管吻合技术及其并发症、以及排斥反应相关的各种研究。 综上所述，简易自体肝移植小型猪模型可以很好的模拟肝移植的过程，这种方法出血少、容易建立，排除了血管吻合及排斥反应对移植肝的影响，并可精确控制各出入肝血流的开放时间，是大动物研究肝移植的一种新的可选方法，可应用于肝脏缺血再灌注损伤、肝动脉开放时间、无肝期等多个方面研究。 参考文献（略) 扫描北京中科医院假中科UM-D
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